Được hỗ trợ bởi Dịch

Nước không chứa nuclease trong ứng dụng sinh học phân tử

Sinh học phân tử được xem là ứng dụng không chỉ đòi hỏi phải được thực hiện trong điều kiện kỹ thuật khắt khe, yêu cầu độ chính xác cao trong từng thao tác mà còn yêu cầu đảm bảo các dụng cụ, thuốc thử không chứa nuclease. Xử lý hóa học bằng diethylpyrocarbonate (DEPC) từ lâu đã là một phương pháp phổ biến để sản xuất ra nước không chứa nuclease. 

Nuclease là phân tử có khả năng làm thoái hóa DNA và RNA bằng cách cắt các liên kết phosphodiester của bộ khung axit nucleic. Mặc dù một số nuclease là công cụ nghiên cứu hữu ích, nhưng chúng thường là mối quan tâm của các nhà khoa học đang tìm cách duy trì tính toàn vẹn của mẫu cho các ứng dụng như PCR, tạo dòng, giải trình tự hoặc chỉnh sửa gen. Vì lý do này, các nhà khoa học cần có thuốc thử và dụng cụ chứa không có nuclease khi thực hiện các ứng dụng liên quan đến axit nucleic.

Nước là thành phần chính của dung dịch đệm và thuốc thử, cũng không được chứa nuclease. Thật không may, nuclease có mặt khắp nơi trong phòng thí nghiệm: chúng thường xuất hiện trên dụng cụ và trong thuốc thử, thậm chí có thể bắt nguồn từ chính kĩ thuật viên thao tác (da, nước bọt,...). Nuclease cũng rất ổn định và khó bị vô hiệu hóa; do đó, xử lý DEPC thường được sử dụng để loại bỏ nuclease khỏi dung dịch. Siêu lọc được xem như một giải pháp thay thế thuận tiện và an toàn hơn phương pháp xử lý DEPC để sản xuất nước không chứa nuclease.

Thuốc thử có chứa nuclease và đặc biệt là nước nếu được sử dụng trong sinh học phân tử có thể dẫn đến kết quả không nhất quán hoặc làm mất các mẫu có giá trị. DEPC là một chất ức chế RNase hiệu quả, không đặc hiệu và đã được sử dụng trong nhiều năm để vô hiệu hóa RNase. Xử lý hóa chất các dung dịch bằng DEPC là một phương pháp hiệu quả, tuy nhiên có một số nhược điểm:
  • Tính an toàn: DEPC được xem là một chất nghi ngờ gây ung thư và cần được xử lý cẩn thận và chú ý nghiêm ngặt đến các khuyến nghị an toàn của nhà sản xuất. Ngoài ra, nếu hóa chất này tiếp xúc với hơi ẩm từ không khí ở nhiệt độ phòng, DEPC có thể bị thủy phân tạo ra carbon dioxide, dẫn đến tích tụ áp suất gây nguy hiểm tiềm tàng
     
  • Mất nhiều thời gian và tiêu tốn năng lượng: Cần một khoảng thời gian để xảy ra phản ứng hóa học giữa DEPC và nuclease, sau đó hấp khử trùng dung dịch để phá hủy DEPC còn tồn dư. Ngoài ra, việc sử dụng nồi hấp khử trùng cũng tiêu thụ một lượng lớn năng lượng điện và nước.
     
  • Tạo ra các chất có thể ảnh hưởng đến thí nghiệm: Khi DEPC bị thủy phân trong quá trình hấp khử trùng, ethanol và carbon dioxide được giải phóng (Hình 1). Ethanol có thể phản ứng với tạp chất hoặc thuốc thử được sử dụng trong các bước thử nghiệm tiếp theo, có khả năng tạo ra các sản phẩm phụ không mong muốn.
    Ngoài ra, DEPC có ái lực mạnh với adenosine và ngay cả khi chỉ còn lại ở mức vết DEPC trong dung dịch, chúng có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm bằng cách biến đổi các nucleotide adenosine (Blots, phản ứng PCR,...). DEPC ở dạng vết cũng có thể phản ứng với các nhóm amin và mercaptan
     
  • Nuclease không bị loại bỏ khỏi nước mà chỉ bị bất hoạt bởi phản ứng hóa học với DEPC

Hình 1. Sự phân hủy DEPC giải phóng chất gây ô nhiễm vào nước

 

Siêu lọc đã được thử nghiệm như một phương pháp thay thế để tạo ra nước không chứa nuclease. Phương pháp này sử dụng các sợi rỗng để phân tách các chất gây ô nhiễm dựa trên kích thước của chúng. Một bộ lọc chứa các sợi siêu lọc polysulfone cắt theo giới hạn trọng lượng phân tử (NMWL) 13000 Da đã được thử nghiệm (Hình 2).

 

       

Hình 2. Sợi rỗng Polysulfone được sử dụng để cấu tạo nên lọc cuối Biopak®

 

Hãng Merck – Millipore đã thực hiện thử nghiệm so sánh hiệu quả bất hoạt nuclease như sau:
Nước siêu tinh khiết được bổ sung RNase A và chia thành ba phần. Các dung dịch gồm (1) được xử lý bằng DEPC và được hấp khử trùng; (2) được xử lý bằng siêu lọc với bộ lọc cuối Biopak®; (3) không được xử lí. RNA ribosome được thêm vào từng dung dịch, ủ trong 20 phút, sau đó điện di trên gel agarose trong điều kiện biến tính được thực hiện.

Kết quả (Hình 3) cho thấy rRNA vẫn còn nguyên vẹn khi dung dịch RNase được lọc lần đầu tiên bằng phương pháp siêu lọc. Việc xử lý DEPC thông thường đối với dung dịch RNase cũng ngăn chặn sự thoái hóa của rRNA một cách tương tự. Ở mẫu đối chứng, khi dung dịch RNase không được xử lý, rRNA đã bị phân hủy. Điều này chứng tỏ rằng hiệu quả của việc loại bỏ RNase bằng siêu lọc tương đương với việc vô hiệu hóa hoạt động của RNase bằng cách xử lý DEPC.

Hình 3. Kết quả điện di trên gel của rRNA trong nước đã được bổ sung RNase
và được xử lý bằng DEPC, siêu lọc và không được xử lý.

 

KẾT LUẬN

Nước không chứa nuclease là cần thiết cho nhiều ứng dụng sinh học phân tử. Không giống như phương pháp xử lý DEPC tốn nhiều thời gian, việc sử dụng bộ siêu lọc là một cách an toàn và thuận tiện để cung cấp nước không chứa nuclease từ hệ thống lọc nước. Phương pháp này mang lại nhiều lợi ích:

  • Thuận tiện sử dụng: Nước không chứa nuclease tinh khiết có thể dễ dàng được sản xuất ngay khi cần. Tiết kiệm thời gian đặt hàng và dự trù khi mua nước DEPC thương mại hoặc mất thời gian xử lý nước bằng DEPC trước khi thực hiện thí nghiệm.
     
  • An toàn: Không cần thao tác với hóa chất DEPC. Ngoài ra, vì không có hóa chất nào được bổ sung vào nước nên không gây nguy cơ gây tạp nhiễm với phản ứng.
     
  • Nước không chứa nuclease có độ tinh khiết cao. Siêu lọc loại bỏ các nuclease khỏi nước thay vì chỉ vô hiệu hóa chúng. Vì bộ lọc được thiết kế để kết nối với đầu ra của hệ thống lọc nước, chẳng hạn như Milli-Q®, nên người dùng có thể thu được nước siêu tinh khiết cũng không chứa nuclease tại điểm phân phối nước.

 



Merck – Millipore là một trong những nhà sản xuất hàng đầu thế giới về các hệ thống lọc nước. Các sản phẩm lọc nước của Merck - Millipore với những công nghệ vượt trội sẽ đem lại nước tinh khiết có chất lượng cao, ổn định và tin cậy cho các ứng dụng của Quý khách hàng.
Đừng ngần ngại liên hệ ngay với chúng tôi để được tư vấn và phục vụ sớm nhất.

 

Tài liệu tham khảo
Nuclease-Free Water at Your Fingertips - Estelle Riche and Stephane Mabic
Millipore S.A.S, Lab Water, Saint-Quentin-en-Yvelines, France
 

 

← Bài trước Bài sau →
Back to top