Được hỗ trợ bởi Dịch

TẦM QUAN TRỌNG CỦA CHẤT LƯỢNG NƯỚC TINH KHIẾT TRONG ỨNG DỤNG GIẢI TRÌNH TỰ

Giải trình tự gen thế hệ mới (Next-generation sequencing - NGS) đã cách mạng hóa nghiên cứu bộ gen và hiện đang đóng một vai trò quan trọng trong lĩnh vực lâm sàng. Các xét nghiệm dựa trên ứng dụng NGS mang lại giá trị to lớn trong việc đánh giá các loại thuốc điều trị mới và ngày càng được sử dụng nhiều hơn để sàng lọc, chẩn đoán và xác định đặc điểm phân tử bệnh ung thư và nhiều bệnh lý khác. 

Sự phát triển của các công cụ bệnh học phân tử này dẫn đường cho việc chăm sóc cá nhân hóa và y tế dự phòng. Các phòng thí nghiệm tiến hành giải trình tự thông lượng cao sử dụng thuốc thử chất lượng cao để có được kết quả tốt nhất. Và nước là một thành phần phản ứng thiết yếu nhưng thường không được chú trọng trong quy trình NGS. Từ làm sạch hệ thống đến chạy giải trình tự, các giai đoạn khác nhau trong quy trình NGS yêu cầu chất lượng nước khác nhau.

Hầu hết các nền tảng NGS khác nhau ngày nay đều dựa trên đều tuân theo một quy trình tương tự nhau (Hình 1). Trong đó, chất lượng nước có thể ảnh hưởng đến từng bước của quy trình này.
 


Hình 1. Quy trình phân tích NGS và các yêu cầu về chất lượng nước sử dụng


Phân mảnh DNA
Chất lượng của thư viện giải trình tự là rất quan trọng trong việc thu được dữ liệu NGS đáng tin cậy. Bước đầu tiên và rất quan trọng trong quy trình NGS là phân mảnh DNA. Nếu sử dụng phương pháp phân cắt bằng sóng âm để phân mảnh DNA thì nước tinh khiết không chứa tiểu phân (ví dụ từ hệ thống Elix®) được khuyến nghị sử dụng cho bể điều nhiệt, bởi vì các tạp chất có thể gây ra sự thay đổi về hiệu quả truyền nhiệt lượng đến mẫu. Khuyến cáo nên thay nước thường xuyên để hạn chế vi khuẩn phát triển và giảm nguy cơ tạp nhiễm mẫu.

Chuẩn bị thư viện axit nucleic
Nước có thể chứa các chất gây tạp nhiễm, mặc dù với lượng nhỏ nhưng có thể trực tiếp ảnh hưởng đến DNA và các phản ứng enzyme trong quá trình chuẩn bị thư viện (ví dụ: sửa chữa, cắt nối, phản ứng PCR). Hoạt động của enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi dấu vết của các phân tử hữu cơ (axit humic), và các ion hoặc kim loại (magiê, sắt,…) có khả năng tồn tại trong nước. Ngoài ra, nuclease trong nước cần được loại bỏ vì có thể làm giảm chất lượng mẫu. Cuối cùng, các chất tạp chất trong nước như các hạt tiểu phân hoặc vi khuẩn có thể làm nhiễm bẩn dụng cụ hoặc lắng đọng trong dây chuyền của bộ xử lý chất lỏng tự động. Do đó, nước siêu tinh khiết không chứa nuclease (ví dụ, từ hệ thống Milli-Q® với lọc cuối Biopak®) được khuyến nghị sử dụng cho các bước này.
Đối với việc định lượng và kiểm tra chất lượng thư viện, có thể sử dụng phương pháp điện di trên gel, trên chip hoặc mao quản. Trong mọi trường hợp, sự di chuyển tối ưu của mẫu đối với điện tích của nó phụ thuộc vào chất lượng nước và việc phát hiện huỳnh quang có thể bị gián đoạn bởi các chất tạp nhiễm hữu cơ. Do đó, để đảm bảo kết quả đáng tin cậy, nên sử dụng nước siêu tinh khiết không chứa ion và chất hữu cơ (điện trở suất 18,2 Mohm.cm; tổng hàm lượng cacbon hữu cơ TOC ở mức <5 ppb) để chuẩn bị dung dịch đệm và pha loãng mẫu.

Giải trình tự thế hệ mới
Quy trình giải trình tự rất nhạy với bất kỳ hoạt động nào của nuclease. Mặc dù tác động của việc nhiễm nuclease có thể không rõ ràng trong thời gian đầu, nhưng theo thời gian sự suy giảm của tín hiệu có thể gây sai lệch cho các kết quả thử nghiệm. Vì lý do này, nước siêu tinh khiết không chứa nuclease được khuyến nghị cho các dung dịch pha loãng đệm và đệm vận hành hệ thống.
•    NGS dựa trên huỳnh quang
Các nền tảng NGS khác nhau về kỹ thuật và về trình tự hóa học, nhưng hầu hết chúng đều dựa vào sự phát hiện tín hiệu huỳnh quang. Ngoài các chất gây ô nhiễm nước nói trên, phải tránh các dấu vết hữu cơ, vì chúng có thể ảnh hưởng đến tín hiệu huỳnh quang. Các chất tạp nhiễm hữu cơ trong nước có thể dập tắt hoặc làm tăng cường tín hiệu huỳnh quang dẫn đến kết quả sai lệch.
•    Bán dẫn ion NGS (Ion semiconductor NGS)
Công nghệ giải trình tự này theo dõi sự kết hợp của các nucleotide bằng cách phát hiện các proton được giải phóng. Sử dụng các máy đo pH siêu nhỏ gắn vào chip cảm ứng bán dẫn, máy sẽ đo tín hiệu điện do ion H+ được giải phóng ra trong quá trình tổng hợp DNA. Do đó, việc phát hiện được thực hiện bằng các phép đo chính xác về sự thay đổi của pH thay vì quang học. Công nghệ này nhạy cảm với bất kỳ sự thay đổi pH nào không xuất phát từ phân tử DNA. Các nhà sản xuất thiết bị đặc biệt khuyến nghị sử dụng nước siêu tinh khiết mới tinh lọc để đảm bảo độ pH gần bằng 7. Điều này là do thực tế là khi nước lưu trữ tiếp xúc với khí quyển, nước siêu tinh khiết hấp thụ CO2 trở nên có tính axit nhẹ (Hình 2) và ảnh hưởng đến quá trình giải trình tự. Vì lý do này, nước siêu tinh khiết phải được làm mới và bảo vệ khỏi tiếp xúc với không khí trước khi sử dụng cho NGS bán dẫn ion.

Hình 2. Sự hấp thụ khí CO2 của nước siêu tinh khiết. Khi nước siêu tinh khiết tiếp xúc với khí quyển, nó sẽ hấp thụ CO2 từ không khí và sản sinh ra axit cacbonic, cacbonate và bicacbonate. Độ pH của nước ban đầu ở mức 7 có thể giảm xuống mức 5,8.




Việt Anh Scientific tự hào là nhà phân phối ủy quyền các dòng máy lọc nước tinh khiết của Merck tại Việt Nam. Đến với chúng tôi, khách hàng sẽ được tư vấn, cung cấp các sản phẩm chất lượng cùng với cơ hội nhận được những ưu đãi hấp dẫn.

Application note: Water for Next-Generation Sequencing, Estelle Riche and Stephane Mabic - Merck, Lab Water

 

 

← Bài trước Bài sau →
Back to top