Nước siêu tinh khiết không chứa BPA sử dụng trong môi trường nuôi cấy phôi

Mối lo ngại về sức khỏe của chất gây rối loạn nội tiết Bisphenol A (BPA)

Chất gây rối loạn nội tiết là những hóa chất can thiệp vào hệ thống nội tiết của người và động vật. Chúng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng cũng như sinh sản, hệ thống miễn dịch và thần kinh, gây ra những hậu quả xấu cho sức khỏe. Chất gây rối loạn nội tiết Bisphenol A (BPA) được coi là có mặt khắp nơi, có nguồn tiếp xúc xúc chính với con người là thông qua chế độ ăn uống. BPA trong thực phẩm và đồ uống chiếm phần lớn mức độ phơi nhiễm hàng ngày của con người. Không khí, bụi và nước cũng có thể xem là những nguồn phơi nhiễm khác. Bisphenol A có thể thấm vào thực phẩm từ lớp phủ nhựa epoxy bảo vệ bên trong của thực phẩm đóng hộp và từ các sản phẩm tiêu dùng như dụng cụ bằng polycarbonate, hộp đựng thực phẩm, chai nước và bình sữa trẻ em, bao gồm cả vật tư tiêu hao nhựa trong phòng thí nghiệm. BPA cũng có thể được tìm thấy trong sữa mẹ.

Các quy chuẩn và tiêu chuẩn quy định liều lượng tối đa các chất gây rối loạn nội tiết được phép có trong thực phẩm và đồ uống cũng như sự hiện diện của chúng trong môi trường. BPA được biết đến như một ‘xenoestrogen’ vì nó bắt chước hormone estrogen và gây ra những lo ngại lớn về sức khỏe. Một số nghiên cứu đã xác nhận rằng BPA can thiệp vào việc sản xuất hormone và sự biểu hiện gen của chúng. Nghiên cứu gần đây tiết lộ rằng ngay cả mức BPA thấp (20 µg/kg/ngày, đại diện cho liều BPA phù hợp với môi trường trong trong 1 tuần thai tiếp xúc) cũng có thể ảnh hưởng đến việc sản xuất tế bào trứng khỏe mạnh (Hình 1), bằng cách can thiệp vào quá trình phát triển của trứng bên trong buồng trứng.

Hình 1. Phân tích hóa mô miễn dịch dưới kính hiển vi của tế bào trứng chuột trong giai đoạn giảm phân metaphase II (MII) bằng cách sử dụng kháng thể kháng protein trong thoi phân bào (màu đỏ) và centrosome (màu xanh lá cây). Nhiễm sắc thể được nhuộm bằng DAPI (màu xanh).

Hãng Merck Millipore đã thực hiện các nghiên cứu để khảo sát chất lượng nước phù hợp cho chuẩn bị môi trường trong các ứng dụng sinh học sinh sản và đảm bảo không chứa BPA.

Nghiên cứu 1: Sử dụng phương pháp sắc kí HP-SPME-GC-MS để phân tích BPA trong nước siêu tinh khiết dùng trong nghiên cứu phôi học

Trong nghiên cứu sinh học sinh sản, nước là thuốc thử chính được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Các nhà khoa học từ Đại học Pavia (Ý) đã sử dụng phương pháp HP-SPME-GC-MS để phân tích hàm lượng BPA trong nước siêu tinh khiết được sử dụng trong nghiên cứu phôi học của họ. Nước siêu tinh khiết được phân phối từ hệ thống Milli-Q® IQ 7000 kết hợp lọc cuối Biopak® dành cho các ứng dụng sinh học phân tử để cung cấp nước không chứa nội độc tố, nuclease, protease và vi khuẩn, với nguồn cấp là nước tinh khiết Elix® từ hệ thống lọc nước trung tâm Milli-Q® HX.

Hình 2. Sơ lược thử nghiệm phân tích bisphenol A (BPA) của các loại nước khác nhau trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp HP-SPME-GC-MS.

Phân tích HP-SPME-GC-MS cho thấy không thể phát hiện BPA trong nước tinh khiết Elix® cũng như nước siêu tinh khiết Milli-Q® được sử dụng cho các thí nghiệm, trong giới hạn phát hiện (LOD) là 4 nM (Bảng 1)

Bảng 1: Nồng độ BPA trong nước máy, nước tinh khiết Elix® và nước được cung cấp bởi hệ thống siêu tinh khiết Milli-Q® IQ 7000 kết hợp lọc cuối Biopak® thấp hơn giới hạn phát hiện 4nM (được đo bằng HP-SPME-GC-MS).

Hình 3 cho thấy kết quả điển hình thu được bằng cách phân tích 3 mẫu nước được phân phối liên tiếp từ hệ thống Milli-Q® IQ 7000 với lọc cuối Biopak® tại điểm sử dụng.

Hình 3. Sắc ký đồ cho thấy hàm lượng BPA trong ba mẫu nước siêu tinh khiết. Các mẫu được lấy liên tục tại thời điểm sử dụng ở điểm phân phối của hệ thống nước siêu tinh khiết Milli-Q® IQ 7000

Kết quả chứng minh rằng chất lượng nước siêu tinh khiết thu được từ hệ thống Milli-Q® IQ 7000 không chứa BPA (giới hạn phát hiện LOD = 4 nM). Đặc biệt, phân tích cho thấy BPA không bị thôi nhiễm từ vật liệu cấu tạo hệ thống vào nước sản phẩm vì không thể phát hiện được BPA trong nước sản phẩm và cả nước cấp cho hệ thống lọc nước.

Hai nghiên cứu tiếp theo chứng minh rằng hệ thống lọc nước siêu tinh khiết Milli-Q® có thể được sử dụng một cách tự tin để cung cấp nước chất lượng cao không nhiễm BPA và tiếp tục sử dụng trong nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất gây rối loạn nội tiết lên sự phát triển của giao tử và phôi, đặc biệt là nước tinh khiết sau khi qua lọc cuối Biopak®.

Nghiên cứu 2: Nước siêu tinh khiết không chứa BPA dùng trong phân tích tế bào học và phân tử nhằm đánh giá tác động của BPA lên sự trưởng thành của tế bào trứng

Trong nghiên cứu được trình bày, các nhà khoa học đã sử dụng qRT-PCR để phân tích biểu hiện phiên mã của bốn gen có ảnh hưởng từ mẹ, Brg1 (chất tái cấu trúc nhiễm sắc thể), Dnmt3a và Dnmt3l (DNA methylase) và Oct-4 (marker của tính vạn năng tế bào). Các mẫu bao gồm 3 nhóm độc lập gồm 10 tế bào trứng chuột ở metaphase II (MII), thu được sau 15 giờ trưởng thành trong ống nghiệm (IVM) của tế bào trứng thứ phát trưởng thành đầy đủ với sự hiện diện của BPA nồng độ lần lượt là 10 nM, 100 nM và 1000 nM

Kết quả cho thấy BPA không ngăn chặn sự trưởng thành của thoi vô sắc ở ba liều thử nghiệm vì phần lớn (96,5%) tế bào trứng đạt đến giai đoạn MII, không có sự khác biệt đáng kể giữa mẫu đối chứng (CTR) và mẫu thử nghiệm. Tuy nhiên, biểu hiện của tất cả các gen được kiểm tra đã bị thay đổi đáng kể ở tất cả các nồng độ BPA được kiểm tra, ngoại trừ Oct-4 không thay đổi ở mức 10 nM BPA (Hình 4).

Các thí nghiệm biểu hiện gen này được thực hiện bằng cách sử dụng nước siêu tinh khiết được phân phối từ hệ thống lọc nước Milli-Q® IQ 7000 với lọc cuối Biopak®. Các kết quả hỗ trợ tính phù hợp của siêu tinh khiết thông qua phân tích biểu hiện gen.

Hình 4. Biểu đồ biểu hiện của các gen Brg1, Dnmt3a, Dnmt3l và Oct-4 trong tế bào trứng của chuột tiếp xúc với BPA ở các nồng độ 10 nM, 100 nM hoặc 1000 nM trong quá trình chuyển đổi GV sang MII. Các giá trị của mẫu đối chứng (CTR) được đặt ở mức 1 để tính toán sự thay đổi. Các giá trị được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SD. *p < 0,05; ** p < 0,001

Nghiên cứu 3: Nước siêu tinh khiết không chứa BPA dùng cho môi trường nuôi cấy sử dụng trong công nghệ hình ảnh tế bào

Hình ảnh time-lapse cho phép quan sát các chuyển động xảy ra bên trong tế bào trứng trong quá trình chuyển từ túi mầm (GV) sang giai đoạn phát triển MII. Những chuyển động này, được gọi là Vận tốc di chuyển tế bào chất (CMV), đóng vai trò như một marker tế bào không xâm lấn để đánh giá khả năng phát triển của giao tử cái. Trong các nghiên cứu được báo cáo, kỹ thuật mới này đã được sử dụng để nghiên cứu CMV xảy ra trong quá trình chuyển đổi GV-MII của tế bào trứng trưởng thành khi vắng mặt hoặc có sự hiện diện của BPA (Hình 5 chỉ hiển thị dữ liệu đại diện cho BPA nồng độ 100 nM).

Hình 5. (A) Hình ảnh đại diện của tế bào trứng GV, được chụp ở khung 1 (a) và của tế bào trứng MII ở khung 100 (b). Các hình nhỏ hiển thị hình ảnh phóng to bằng các mũi tên (vectơ vận tốc) biểu thị cường độ và hướng chuyển động của tế bào chất. Màu sắc và độ dài của mũi tên biểu thị mô-đun vận tốc của chuyển động so với khung trước đó. Thanh tỷ lệ vectơ màu (nm/phút): màu xanh lam biểu thị vận tốc thấp; màu tím biểu thị tốc độ cao. Thanh: 10 mm. (B) Biểu đồ chuyển động của tế bào chất trong quá trình chuyển đổi GV sang MII của tế bào trứng chuột khi không có (màu xanh lá cây) hoặc có hiện diện (màu xám) của BPA 100 nM. * p < 0,05.

Phân tích Vận tốc hình ảnh hạt tế bào (Cell PIV) chỉ ra các khoảng thời gian phát triển cụ thể khi tế bào trứng nhạy cảm với liều BPA được thử nghiệm. Đáng chú ý, khi tiếp xúc với nồng độ BPA thấp 10 nM, những thay đổi trong CMV được phân tán tại các thời điểm riêng lẻ, trong khi ở liều cao hơn, những thay đổi trong CMV có thể nhìn thấy được trong khoảng thời gian kéo dài trong quá trình chuyển đổi GV sang MI. Cụ thể, nồng độ 100 nM dẫn đến sự khác biệt đáng kể trong khoảng thời gian khi chất nhiễm sắc cô đặc và tâm động tập hợp thành vùng nhiễm sắc lớn để tạo thành tấm MI (Hình 5)

Môi trường nuôi cấy sử dụng trong các thí nghiệm CMV trên được chuẩn bị bằng nước siêu tinh khiết được cung cấp từ hệ thống lọc nước Milli-Q® IQ 7000 với lọc Biopak®. Kết quả nhấn mạnh sự cần thiết của môi trường nuôi cấy không chứa BPA vì ngay cả liều BPA thấp 100 nM cũng có thể có ảnh hưởng đến nuôi cấy phôi, được phát hiện thông qua phân tích biểu hiện gen hoặc chuyển động của tế bào chất.

Kết luận

Độ nhạy và hiệu suất ngày càng tăng của các kỹ thuật nghiên cứu đòi hỏi nước tinh khiết chất lượng cao để ngăn ngừa ô nhiễm có thể ảnh hưởng đến tính chính xác và xác thực của kết quả thí nghiệm. Đặc biệt là trong các nghiên cứu liên quan đến phân tích mang tính đột phá cao, các nhà khoa học yêu cầu nước có độ tinh khiết cao để ngăn chặn mọi thách thức có thể làm ảnh hưởng đến kết quả (ví dụ: BPA, nội độc tố, nuclease, protease và vi khuẩn) và để có độ tin cậy cao hơn trong các thử nghiệm phân tích.

Trong lĩnh vực phôi học, ngay cả mức độ thấp của chất gây rối loạn nội tiết BPA cũng đã được chứng minh là có thể ảnh hưởng đến nghiên cứu tạo phôi bằng cách can thiệp vào sự phát triển của tế bào trứng. Điều này đáng lo ngại vì BPA có thể thôi nhiễm từ các vật tư tiêu hao và thiết bị trong phòng thí nghiệm, gây ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.

Thông qua các thử nghiệm trên, mặc dù đã chỉ ra rằng mức BPA thấp không ngăn cản sự trưởng thành của thoi vô sắc, nhưng nồng độ BPA rất thấp chỉ 10 nM cũng đã ảnh hưởng đến cả biểu hiện gen và chuyển động xảy ra bên trong tế bào trứng trong quá trình chuyển từ túi mầm GV sang MII ở giai đoạn phát triển. Những kết quả này nhấn mạnh sự cần thiết phải thực hiện các thí nghiệm phôi học trong môi trường không chứa BPA, bao gồm cả việc sử dụng nước siêu tinh khiết được đảm bảo có mức BPA dưới ngưỡng có thể phát hiện được.

Nước siêu tinh khiết được cung cấp từ hệ thống lọc nước siêu tinh khiết Milli-Q® IQ 7000 kết hợp lọc cuối Biopak® đã được chứng minh là không chứa BPA, ở giới hạn phát hiện thậm chí rất thấp chỉ 4nM. Do vậy, nước siêu tinh khiết được cung cấp bởi hệ thống này có thể được tự tin sử dụng để nghiên cứu tác động của các chất gây rối loạn nội tiết lên sự phát triển của giao tử và phôi.