Định lượng Protein và Peptide ở bước sóng 205nm với Máy quang phổ NanoDrop One/OneC

Điều gì xảy ra nếu mẫu Protein hoặc Peptide của bạn thiếu hụt Tyrosine và Tryptophan, từ đó không thể định lượng nồng độ mẫu được tại bước sóng 280nm?

------------------------

Định lượng Protein chính xác là điều cần thiết đối với các nghiên cứu về Protein cũng như trong các ứng dụng Giải trình tự, PCR, RT-PCR, Microarray, Tạo dòng- Cloning, Western blotting, Nuôi cấy tế bào… 

Các phương pháp định lượng protein bao gồm:

• Các phương pháp gián tiếp như BCA, Bradford, Lowry và Pierce 660nm là các phương pháp đo lường dựa trên đường cong chuẩn và phản ứng tạo ra sự thay đổi màu sắc tỷ lệ thuận với lượng protein trong mẫu. Protein trong các hỗn hợp phức tạp như dịch chiết tế bào hoặc dịch ly giải được đo tốt nhất bằng cách sử dụng xét nghiệm so màu protein.
• Các phương pháp truyền thống đo trực tiếp độ hấp thụ UV ở bước sóng 280nm và 205nm tính toán nồng độ protein trực tiếp.

Trong đó, phương pháp đo độ hấp thụ tia cực tím (UV) quang phổ với mẫu vi thể tích tại các bước sóng đặc trưng là một sự lựa chọn phổ biến cho các nhà nghiên cứu vì chúng dễ thực hiện, không yêu cầu thuốc thử hoặc chất chuẩn và tiêu tốn rất ít mẫu.

Định lượng Protein ở bước sóng 280 nm:

Các axit amin thơm Tyrosine và Tryptophan cung cấp cho Protein khả năng hấp thụ tia cực tím (UV) đặc trưng ở bước sóng 280nm, thường được dùng để ước tính nồng độ protein. Các liên kết phenylalanin và disulfua cũng góp phần hấp thụ ở bước sóng 280nm, mặc dù hơi nhỏ. Phương pháp định lượng Protein A280 rất đơn giản và có thể được thực hiện với thể tích mẫu cực nhỏ (nhỏ nhất là 0,5uL). Tuy nhiên, chúng ta phải luôn đảm bảo mẫu đo không được chứa bất kỳ thành phần nào khác ngoài protein có khả năng hấp thụ đáng kể ở bước sóng 280nm, chẳng hạn các chất tạp nhiễm như axit nucleic.

• Công nghệ Acclaro tích hợp trên máy quang phổ NanoDrop One/OneC giúp phát hiện tạp nhiễm axit nucleic trong các mẫu protein và điều chỉnh kết quả nồng độ bằng các thuật toán.

Hình 1: Phương pháp quang phổ hấp thụ 

Định lượng Protein ở bước sóng 205nm:

Điều gì xảy ra nếu mẫu Protein hoặc Peptide của bạn thiếu hụt Tyrosine và Tryptophan, từ đó không thể định lượng nồng độ mẫu được tại bước sóng 280nm?

Do peptide backbone của Protein hấp thụ ở bước sóng 190 – 220nm nên có thể định lượng các peptide thiếu gốc Tyrosine hoặc Tryptophan bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 205nm.

Phương pháp định lượng Protein A205 có một số ưu điểm hơn phương pháp Protein A280 chẳng hạn như:

• Độ biến thiên protein-to-protein thấp hơn: Vì hệ số tắt ϵ205 của phương pháp A205 không dựa trên thành phần amino acid.
• Độ nhạy cao hơn: Vì độ hấp thụ phân tử protein cao hơn ở bước sóng 205nm.

Vì những hạn chế về mặt kỹ thuật trước đây khiến việc thực hiện các phép đo này gặp nhiều khó khăn: Hiệu suất nhiễu xạ của máy quang phổ, độ tuyến tính các bước sóng UV sâu và dung dịch đệm protein có chứa các thành phần hấp thụ được ở tia cực tím UV là những yếu tố gây trở ngại trong việc đo lường tại bước sóng 205nm.

Để giải quyết những hạn chế trên, công nghệ cột dung dịch đo mẫu vi thể tích và hiệu suất nhiễu xạ thấp của máy quang phổ NanoDrop đã giúp đơn giản hóa việc định lượng Protein bằng phương pháp A205 (Hình 2)

Hình 2: Cột dung dịch mẫu đo vi thể tích được hình thành giữa tay đo và bệ đo của máy quang phổ NanoDrop

Sử dụng NanoDrop One/OneC để định lượng Protein và chuẩn bị Peptide:

Người dùng có thể định lượng các mẫu Peptide và Protein trên Máy quang phổ NanoDrop One/OneC UV-Vis của hãng Thermo Scientific thông qua các ứng dụng về độ hấp thụ trực tiếp được lập trình sẵn A205 và A280, giúp tăng cường hiệu quả trong việc định lượng protein, cung cấp độ nhạy nâng cao để định lượng peptides trong vài giây chỉ từ 2 μL mẫu. (Hình 3 - 4)

Hình 3: Màn hình hiển thị chính của máy NanoDrop One với các ứng dụng được lập trình trước để định lượng Protein

Hình 4: Máy quang phổ định lượng DNA/RNA/Protein của Thermo Scientific - NanoDrop One và OneC
 

Trong ứng dụng định lượng Protein A205 trên máy NanoDrop One, người dùng có thể lựa chọn giữa ba chương trình đo khác nhau (Hình 5)

• Chương trình ϵ205 = 31 là hệ số tắt thường được sử dụng cho các peptides thiếu dư lượng tryptophan (Trp) và tyrosine (Tyr).
• Phương pháp Scopes lý tưởng cho các protein có chứa một lượng đáng kể dư lượng Trp và Tyr và dựa trên tỷ lệ A280/A205.
• Phương pháp Other có thể tùy chỉnh cho nhiều loại protein và peptides đa dạng. Phương pháp này thích hợp cho các quy trình tinh sạch protein hoặc peptides mà trình tự axit amin đã được biết, hoặc các peptides thiếu axit amin thơm.

Hình 5: Màn hình lựa chọn các phương pháp cho phép đo A205 trên máy NanoDrop One

Ngoài định lượng Protein ở bước sóng 280nm và 205nm, các dòng máy NanoDrop của hãng Thermo cũng hỗ trợ định lượng theo các phương pháp đo màu như Bradford, BCA, Lowry… (Hình 6 - 7)

Hình 6: Các phép đo Protein bằng máy quang phổ NanoDrop
 

Hình 7: Màn hình kết quả định lượng mẫu Protein bằng phương pháp BCA trên Máy quang phổ NanoDrop One/Oneᶜ: Kết quả cho thấy tổng nồng độ protein (tại 3 vị trí ký hiệu màu đỏ) và đường chuẩn

Hiệu suất định lượng Protein A205 trên máy quang phổ NanoDrop One:

Thử nghiệm trên Mẫu đo polymyxin - một loại kháng sinh tẩy rửa cation với peptide backbone, không có dư lượng Trp hoặc Tyr, được chuẩn bị trong dung dịch đệm Brij® 35 0,01% và được đo trên 2 dòng máy quang phổ của hãng Thermo: Máy NanoDrop One và máy Evolution 300.

Đối với máy quang phổ NanoDrop, lấy 2 µL mẫu đo pipet trực tiếp trên bệ đo, trong khi máy quang phổ Evolution 300 dùng cuvet thạch anh 10 mm. Dữ liệu nồng độ polymyxin thu được trên cả hai thiết bị được vẽ trên đồ thị (Hình 8):

Hình 8: Đồ thị kết quả đo mẫu Polymyxin trên máy NanoDrop One và máy Evolution 300 

• Đồ thị kết quả các phép đo nồng độ Protein A205 trên NanoDrop và Evolution 300 tuyến tính với nhau, cho thấy khả năng phù hợp của NanoDrop One đo mẫu vi thể tích – tương đương với máy quang phổ truyền thống đo cuvet.

Mua máy NanoDrop ở đâu tại Việt Nam để có giá tốt nhất và hỗ trợ kỹ thuật chính hãng?

Công ty TNHH Thiết bị Khoa học Việt Anh là nhà phân phối ủy quyền các dòng máy NanoDrop của Thermo Fisher Scientific tại Việt Nam. Liên hệ ngay với chúng tôi để có cơ hội trải nghiệm các sản phẩm chất lượng cùng với cơ hội nhận được những ưu đãi hấp dẫn.

Tài liệu tham khảo:

1. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Application-Notes/AN52774-quantify-protein-peptide-preparations-205-nm.pdf
2. Anthis, NJ and Clore, GM 2013. Sequence-specific determination of protein and peptide concentrations by absorbance at 205 nm. Protein Science 22:851-858.
3. Goldfarb, AR, Saidel, LJ, Mosovich E 1951. The ultraviolet absorption spectra of proteins. Journal of Biological Chemistry 193(1):397-404.
4. Scopes, RK 1974. Measurement of protein by spectrophotometry a 205 nm. Analytical Biochemistry 59:277-282.