Tầm quan trọng của việc lựa chọn chất lượng nước phù hợp cho phân tích HPLC và LC-MS

Trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), để tối ưu hóa kết quả phân tích yêu cầu sử dụng dung môi và thuốc thử có độ tinh khiết cao. Việc lựa chọn muối và dung môi hữu cơ sử dụng trong pha động thường được chú trọng, trong khi vai trò của chất lượng nước lại chưa được đánh giá đúng mực. Sự hiện diện của các chất hữu cơ vi lượng trong nước dùng cho dung dịch rửa giải có thể dẫn đến kết quả kém kéo dài. Theo thời gian, hiệu suất cột có thể giảm đi, dẫn đến giảm độ phân giải và xuất hiện các peak kéo đuôi. Sự hiện diện của các chất hữu cơ vi lượng trong nước có thể ảnh hưởng đáng kể đến kết quả phân tích LC-MS. Điều này đặc biệt đúng nếu các chất ô nhiễm hữu cơ dễ bị ion hóa và có khối lượng tương đương với chất cần phân tích.

Hãng Merck - Millipore đã thực hiện nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của chất lượng nước đối với các phép phân tích HPLC và LC-MS. Nước đóng chai cấp HPLC thương mại trên thị trường được sử dụng để so sánh với nước được xử lý bằng hệ thống lọc nước tinh khiết. Một hỗn hợp gồm 7 loại thuốc được phân tách bằng cách sử dụng một dải acetonitrile pha với nước cấp HPLC hoặc nước siêu tinh khiết mới được sản xuất. Các cột riêng biệt cùng loại được sử dụng cho hai pha động khác nhau. Phân tích được thực hiện lặp lại 1310 lần và sắc ký đồ được so sánh.

• Hỗn hợp thuốc: Các chất chuẩn sắc ký thuốc dưới dạng dung dịch 1 mg/mL trong metanol được chuẩn bị bao gồm: Acetaminophen (1), Acetazolamid (2), Phenobarbital (3), Carbamazepine (4), Phenytoin (5), Secobarbital (6), Nabumetone (7). Một hỗn hợp chứa 0,200 µg/mL của mỗi loại thuốc đã được điều chế.
• Pha động: Nước và acetonitrile được sử dụng làm pha động. Có hai nguồn nước: nước cấp HPLC thương mại và nước siêu tinh khiết từ hệ thống Milli-Q® Advantage A10 (Merck Millipore) với lọc cuối Millipak®-20 Express 0,22 µm (Merck Millipore). Nước siêu tinh khiết được sản xuất mới từ hệ thống Milli-Q® Advantage A10 trước khi sử dụng. Acetonitrile cấp HPLC. Dung dịch pha động sắc ký được đồng nhất bằng sóng âm trước khi sử dụng.

Hỗn hợp được bơm vào mỗi cột 1310 lần liên tiếp. Quá trình phân tách HPLC của 7 loại thuốc đạt yêu cầu trong suốt thời gian thí nghiệm, khi phân tích với cả 2 loại nước cấp HPLC và nước siêu tinh khiết từ máy lọc nước của Merck Millipore (Hình 1).

Hình 1. Sắc ký đồ của acetaminophen (1), acetazolamide (2), phenobarbital (3), carbamazepine (4), phenytoin (5), secobarbital (6), nabumetone (7) ở bước sóng 214 nm với nước cấp HPLC/acetonitrile trong pha động

Khi nước cấp HPLC thương mại được sử dụng để chuẩn bị dung dịch rửa giải, đường nền biến động nhiều theo mỗi lần chạy phân tích (Hình 2A). Đường nền lại ít biến động khi sử dụng nước siêu tinh khiết (Hình 2B).

Hình 2. Sắc ký đồ ở bước sóng 214 nm sử dụng (A) nước đóng chai cấp HPLC, (B) nước siêu tinh khiết với TOC < 5 ppb trong pha động.

Độ biến động của đường nền cũng được quan sát thấy ở bước sóng 254 nm khi nước cấp HPLC được sử dụng trong dung dịch rửa giải (Hình 3A và 3B).
Theo thời gian, một tín hiệu “ghost peak” xuất hiện trong khoảng 5 phút khi sử dụng nước đóng chai cấp HPLC (Hình 3A). Trong khi không có “ghost peak” nào xuất hiện khi sử dụng nước siêu tinh khiết (Hình 3B)

Hình 3. Sắc ký đồ ở bước sóng 254 nm với (A) nước cấp HPLC, (B) nước siêu tinh khiết TOC < 5 ppb trong pha động. Lưu ý sự xuất hiện của ghost peak trong sắc ký đồ A.

• Ghost peak có thể do các tạp chất hữu cơ tập trung ở phần đầu cột sau đó được giải phóng ra ngoài. Độ biến động của đường nền cũng có thể là do các tạp chất hữu cơ có trong dung dịch rửa giải được chuẩn bị với nước đóng chai cấp HPLC.
• Sử dụng nước siêu tinh khiết mới được phân phối với mức TOC thấp mang lại lợi thế hơn so với nước cấp HPLC với đường nền ổn định không có ghost peak, ngay cả sau 1310 lần tiêm mẫu. Nước siêu tinh khiết được sử dụng cho nghiên cứu này không chứa ion (điện trở suất là 18,2 MΩ.cm ở 25°C) và chứa hàm lượng TOC <5 ppb.

Quá trình oxy hóa bằng tia cực tím (UV)

Các phân tích HPLC thường khuyến nghị sử dụng nước đóng chai cấp HPLC để chuẩn bị pha động. Loại nước này có độ hấp thụ tia UV thấp và không chứa các tiểu phân. Tuy nhiên, nước cấp HPLC thương mại này hiếm khi công bố các thông số kỹ thuật về hàm lượng tạp chất hữu cơ (TOC). Những tạp chất như vậy có thể gây bất lợi trong phân tích HPLC, đặc biệt là trong chạy gradient. Chúng có thể tập trung ở đầu cột và xuất hiện dưới dạng các ghost peak. Điều này có thể gây khó khăn trong việc phân tích sắc ký đồ. Ngoài ra, các tạp chất hữu cơ có thể dẫn đến biến động đường nền và ảnh hưởng đến độ nhạy của phân tích.

Hình 4. (A) Sắc ký đồ khối phổ của nước siêu tinh khiết có và không có quá trình oxy hóa bằng tia UV. (B) Khối phổ cực đại ở phút 13,1 đối với nước không được oxy hóa bằng tia UV (TOC = 12 ppb). (C) Khối phổ cực đại ở phút 13,1 đối với nước được xử lý bằng quá trình oxy bằng tia UV (TOC = 4 ppb).

Tổng kết

Sử dụng nước siêu tinh khiết mới sản xuất với TOC thấp (< 5 ppb) để chuẩn bị pha động giúp đạt và duy trì hiệu suất sắc ký tốt. Không giống như nước cấp HPLC đóng chai, việc sử dụng nước siêu tinh khiết chất lượng cao sẽ giảm thiểu độ biến động đường nền và hạn chế sự xuất hiện của các ghost peak trong phân tích HPLC. Điều này rất quan trọng để xác định rõ ràng các peak và để định lượng các chất phân tích. Sử dụng một bộ tiền lọc hiệu quả và các bước lọc tiếp theo bao gồm quá trình oxy hóa bằng tia UV giúp tối ưu việc loại bỏ các tạp chất hữu cơ khỏi nước.

Merck - Millipore là một trong những nhà sản xuất hàng đầu thế giới về các hệ thống lọc nước tinh khiết và siêu tinh khiết, luôn đi đầu trong việc cải tiến công nghệ để mang đến chất lượng sản phẩm tốt nhất.

Hình 5. Hệ thống Milli-Q® IQ 7003, 7005, 7010 và 7015 với sự kết hợp của nhiều công nghệ hiện đại đã nhận được giải thưởng SelectScience®’s Scientists’ Choice Awards từ bình chọn của các nhà khoa học ở hạng mục thiết kế sản phẩm bền vững trong năm 2022.

Công ty TNHH Thiết bị Khoa học Việt Anh vinh dự là đối tác phân phối chính thức các thiết bị lọc nước của Merck Millipore tại Việt Nam. Vui lòng liên hệ với chúng tôi để được hỗ trợ tư vấn và phục vụ sớm nhất.

Tài liệu tham khảo

The Importance of Water Quality in HPLC and LC-MS Analyses